เป็นผ้าเอกลักษณ์ประจำจังหวัดมุกดาหาร เป็นการนำลายผ้าโบราณ มามัดเป็นลวดลายและย้อมสีบนเส้นไหมและทอเป็นผืนผ้า แต่ละลายมีเอกลักษณ์และความหมายสำหรับจังหวัดมุกดาหาร จำนวน 5 ลายดังนี้

1.ลายสายน้ำ (ลายง๊อกแง๊ก หรือลายซิกแซก) มีลักษณะเป็นเส้นโค้งสีขาว หมายถึงสัญลักษณ์แทนแม่น้ำโขง ซึ่งเป็นสายน้ำคู่จังหวัดมุกดาหาร ซึ่งเป็นเส้นกันเขตแดนระหว่างประเทศไทยและประเทศสาธารณรัฐประชาชนลาว

2. ลายนาคน้อย (หรือลายพญานาค) หมายถึง พญานาคที่อาศัยในแม่น้ำโขง เฝ้าดูแลความเป็นอยู่ของชาวเมืองมุกดาหาร นาคเป็นสัตว์แห่งความอุดมสมบูรณ์ เกี่ยวกับพุทธศาสนา ชาวอีสานจะมีการนับถือนาคเป็นวัฒนธรรมร่วมกัน จะปรากฏมีลายนาคบนผืนผ้าของชาวอีสานมากมายหลายแบบ

3.ลายดอกช้างน้อย (ลายดอกกระบวนน้อย) เป็นลายสีเหลืองดอกซ้างน้าว ซึ่งเป็นไม้มงคลจังหวัดมุกดาหาร

4.ลายตุ้มเล็ก (ตุ้มลายไม้) แทนดวงแก้วเล็ก (ดวงดาวบนท้องฟ้า)

5.ลายตุ้มใหญ่ หรือลายมุก มีลักษณะเป็นดอกสีขาว หรือที่เรียกว่าลายตุ้ม หมายถึงแก้วมุกดา ซึ่งเป็นสิ่งศักดิ์สิทธิ์คู่บ้านคู่เมืองของชาวเมืองมุกดาหาร

ลักษณะเด่นของผ้ามัดหมี่ลายแก้วมุกดาเป็นผ้ามัดหมี่ 5 สี คือ สีฟ้า สีเหลืองเข้ม สีน้ำเงิน สีขาว และสีบานเย็น คั่นด้วยเส้นไหม 4 สี ได้แก่ เส้นไหมหางกระรอก (สีน้ำเงิน+ขาว) สีบานเย็น สีเหลือง สีฟ้าคราม ทอแบบ 5 กระสวย